Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Genleri Genleştirmeye Çalışması

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir genin çoklu kopyalarını yapmak için moleküler genetik bir tekniktir ve aynı zamanda gen dizilendirme sürecinin bir parçasıdır.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nasıl Çalışır?

Gen kopyaları bir DNA örneği kullanılarak yapılır ve teknoloji, numunedeki genin tek bir kopyasından çoklu kopyalar çıkaracak kadar iyidir. Milyonlarca kopya üretmek için bir genin PCR amplifikasyonu, DNA parçasının büyüklüğüne ve yüküne (+ veya -) dayalı görsel teknikler kullanarak gen dizilerinin saptanmasına ve tanımlanmasına izin verir.

Kontrollü koşullar altında, DNA'nın küçük parçaları DNA polimeraz olarak bilinen, "şablon" olarak bilinen DNA parçasına tamamlayıcı deoksinükleotitler (dNTP'ler) ekleyen enzimler tarafından üretilir. Polimerazın başlangıç ​​noktası olarak "primerler" olarak adlandırılan daha küçük DNA parçaları bile kullanılır. Primerler insan yapımı küçük DNA parçacıklarıdır (oligomer), genellikle 15-30 nükleotid uzunluğundadır. Bunlar, genin çoğaltılıp çoğaltılan kısa DNA dizilerini bilmek ya da tahmin ederek yapılır. PCR sırasında, dizilen DNA, ısıtılır ve çift teller ayrılır. Soğutulduktan sonra, primerler şablona bağlanır (tavlama denir) ve polimerazın başlaması için bir yer yaratır.

PCR Tekniği

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), termofiller ve termofilik polimeraz enzimleri (yüksek sıcaklıklarda ısıtıldıktan sonra yapısal bütünlüğü ve işlevselliği koruyan enzimler) keşfi ile mümkün olmuştur.

PCR tekniğindeki adımlar aşağıdaki gibidir:

DNA şablonunun, polimeraz enziminin, primerlerin ve dNTP'lerin optimize edilmiş konsantrasyonları ile bir karışım oluşturulur. Karışımı enzimi denatüre etmeden ısıtma özelliği, 94 santigrad derece sıcaklıktaki DNA örneğinin çift helezonunun denatüre edilmesini sağlar.

Denatürasyon sonrasında numune, primerlerin tek sarmallı DNA şablonlarına bağlanmasını kolaylaştıran 54 derece civarında daha ılımlı bir aralığa soğutulur.

• Çevrimin üçüncü aşamasında örnek, Taq DNA Polymerase için ideal sıcaklık olan uzama için 72 dereceye ısıtıldı. Uzama esnasında, DNA polimeraz, her bir primerin 3 'uçlarına tamamlayıcı dNTP'ler eklemek için bir şablon olarak orijinal DNA zincirini kullanır ve ilgilenilen gen bölgesinde bir çift sarmallı DNA'nın bir bölümünü üretir.
• Tam bir eşleşme olmayan DNA dizilerine tavlanmış primerler 72 derecede tavlanır ve bu nedenle ilgi genindeki uzamayı sınırlamaz.
• Bu denatüre etme, tavlama ve uzatma işlemi, çoğaltılmış (30-40) kez tekrarlanır ve böylece karışımdaki istenen gen kopya sayısını katlanarak arttırır.Elle gerçekleştirilirse bu işlem oldukça sıkıcı olmasına rağmen, örnekler hazırlanabilir ve programlanabilir bir Thermocycler'da (şu anda çoğu moleküler laboratuvarlarda alışılmış) kuluçkalanabilir ve 3-4 saat içinde tam bir PCR reaksiyonu gerçekleştirilebilir.

Her denatüre adım, bir önceki döngünün uzama sürecini durdurur, böylece yeni DNA zincirini keser ve onu yaklaşık olarak istenen genin büyüklüğüne tutar.

Uzatma döngüsünün süresi ilgilenilen genin büyüklüğüne bağlı olarak daha uzun veya daha kısa yapılabilir, ancak nihai olarak tekrarlanan PCR döngüleri aracılığıyla şablonların çoğu yalnızca tek başına ilgilenilen gen boyutuyla sınırlandırılacaktır , çünkü her iki primerin ürünlerinden üretilmiş olacaklardır.

Sonuçların iyileştirilmesi için manipüle edilebilir başarılı PCR için birkaç farklı faktör vardır. PCR ürününün varlığını test etmek için en yaygın kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir. DNA parçalarını boyuta ve şarj esasına göre ayırmak için kullanılır. Parçacıklar daha sonra boyalar veya radyoizotoplar kullanılarak görselleştirilir.

Evrim

PCR keşfinden bu yana, orijinal Taq'dan başka DNA polimerazları keşfedildi. Bunlardan bazıları daha iyi "düzeltme" kabiliyetine sahiptir veya daha yüksek sıcaklıklarda daha kararlıdır, böylece PCR özgüllüğünü arttırır ve hatalı dNTP'nin eklenmesinden kaynaklanan hataları azaltır.

PCR'ın bazı varyasyonları spesifik uygulamalar için tasarlanmış olup şimdi moleküler genetik laboratuarlarında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları Gerçek Zamanlı PCR ve Ters Transkriptaz PCR'dır. PCR keşfi aynı zamanda DNA dizilimi, DNA parmak izi ve diğer moleküler teknikler geliştirmesine yol açmıştır.