DNA sekanslama teknikleri < Için biyoteknoloji alanında Biyoteknoloji Endüstrisi

Biyoteknoloji alanı sürekli değişmelerden biridir. En ileri araştırmaların hızlı bir şekilde büyümesi ve geliştirilmesi, bilim insanlarının yenilikçiliğine ve yaratıcılığına ve potansiyelini temel bir moleküler tekniğide görme ve yeni süreçlere uygulayabilme becerilerine bağlıdır. PCR'nin ortaya çıkışı, genetik araştırmalarda, DNA analizi ve DNA dizilerine dayanan farklı genlerin tanımlanması gibi birçok kapıyı açtı.

DNA dizilimi aynı zamanda, bir baz çifti kadar küçük boyuttaki DNA dizilerini ayırmak için jel elektroforezini kullanma kabiliyetimize de bağımlıdır.

DNA Dizilemesi

1970'lerin sonlarında, daha uzun DNA molekülleri için iki DNA sıralama tekniği icat edildi. Bunlar Sanger (veya dideoksi) yöntemi ve Maxam-Gilbert (kimyasal bölünme) yöntemi idi. Maxam-Gilbert yöntemi, kimyasallarla nükleotit-spesifik bölünmeye dayanır ve en iyi oligonükleotidleri (kısa nükleotid polimerleri, genellikle 50 baz çiftinden daha kısa uzunlukta) dizmek için kullanılır. Sanger yöntemi, teknik olarak daha kolay uygulanması kanıtlandığından ve PCR'nin gelişiyle ve tekniğin otomasyonu ile bazı tüm genleri de içeren uzun DNA dizilerine kolayca uygulanır, daha yaygın olarak kullanılır. Bu teknik, PCR uzatma reaksiyonları sırasında dideoksinükleotitlerin zincir sonlandırmasına dayanır.

Sanger Yönteminde, analiz edilecek olan DNA zinciri bir şablon olarak kullanılır ve DNA polimeraz, bir PCR reaksiyonunda, primerler kullanılarak serbest şeritler oluşturmak için kullanılır. Her biri dört nükleotidden (ATP, CTP, GTP veya TTP) birine belli oranda dideoksinükleosid trifosfat (ddNTP) analogları içeren dört farklı PCR reaksiyon karışımı hazırlanır. Yeni DNA sarmalının sentezi, bu analoglardan biri dahil edilinceye kadar devam eder, bu sırada sarmal erken kesilir.

Her bir PCR reaksiyonu, farklı uzunlukta DNA iplikçiklerinden oluşan bir karışım içeriyor ve bu reaksiyonun tamamı, bu reaksiyon için dideoksi ile işaretlenmiş nükleotid ile bitiyor. Jel elektroforezi daha sonra dört reaksiyonun dizilimlerini dört ayrı şeride ayırmak için kullanılır ve hangi şeritlerin uzunlukları nükleotid ile biten orijinal şablonun sırasını belirler.

Otomatik Sanger reaksiyonunda, dört farklı renkli flüoresan etiketi ile etiketlenmiş primerler kullanılır. Farklı dideoksi nükleotidlerinin mevcudiyetinde PCR reaksiyonları yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. Bununla birlikte, daha sonra dört tepkime karışımı birleştirilir ve tek bir jel şeridine uygulanır. Her fragmanın rengi bir lazer ışını kullanılarak tespit edilir ve bilgi, şablon DNA sekansının belirlenebileceği her rengin tepe noktalarını gösteren kromatogramlar üreten bir bilgisayar tarafından toplanır.

Genellikle, otomatik dizileme yöntemi yalnızca maksimum 700-800 baz çift uzunluğundaki diziler için doğrudur. Bununla birlikte, Primer Yürüyüş ve Shotgun dizilimi gibi kademeli yöntemleri kullanarak daha büyük genlerin ve aslında tüm genom dizilerinin elde edilmesi mümkündür.

Primer Walking

'da, daha büyük bir genin uygulanabilir bir kısmı Sanger yöntemi kullanılarak dizilenir. Yeni primerler, dizinin güvenilir bir bölümünden üretilir ve orijinal reaksiyonların aralığının dışına çıkan gen bölümünün dizilimine devam etmek için kullanılır.

Shotgun dizilemesi , ilgilenilen DNA parçasını rastgele daha uygun (yönetilebilir) boyutlu fragmanlara kesip, her fragmanın sıralamasını ve üst üste binen dizilere dayalı parçaları düzenlemeyi gerektirir. Bu teknik, çakışan parçaların düzenlenmesi için bilgisayar yazılımının uygulanmasıyla daha kolay hale getirilmiştir.