Yöntemleri

Biyoteknoloji araştırmalarının önemli bir kısmı, belirli endüstri uygulamaları için optimize edilmiş özelliklere sahip proteinler tasarlamak veya değiştirmek için protein mühendisliği tekniklerini kullanmaktır. Bunu yapmak için bilim adamı, ilgi proteinlerini izole etmek ve saflaştırmak zorundadır, böylece onların konformasyonları, substrat spesifiteleri, diğer ligandlarla reaksiyonları ve spesifik aktiviteler incelenebilir.

Gerekli protein saflığı derecesi, proteinin amaçlanan son kullanımına bağlıdır.

Bazı uygulamalar için ham özüt yeterlidir. Bununla birlikte, gıdalar ve farmasötik ürünler gibi diğer kullanımlar için yüksek saflık derecesi gereklidir. Bunu başarmak için, bir dizi saflaştırma aşamasında tipik olarak birkaç protein saflaştırma yöntemi kullanılır.

Her bir protein saflaştırma aşaması genellikle bir miktar ürün kaybına neden olur. Bu nedenle, ideal bir protein saflaştırma stratejisi, en üst düzeyde saflaştırmanın en az adımda ulaşıldığı stratejidir. Hangi aşamaların kullanılacağının seçimi, hedef proteinin boyutuna, yüküne, çözünürlüğüne ve diğer özelliklerine bağlıdır. Aşağıdaki teknikler, tek bir sitozolik proteinin saflaştırılması için en uygun yöntemlerdir. Sitosolik protein komplekslerinin saflaştırılması daha karmaşıktır ve genellikle farklı yöntemlerin uygulanmasını gerektirir.

Protein Saflaştırma için İlk Adımlar

hücre içi (hücre içinde) proteinlerin saflaştırılmasında ilk adım ham özütün 'un hazırlanmasıdır.

Ekstrakt hücre sitoplazmasından ve bazı ek makromoleküllerden, kofaktörlerden ve besleyicilerden gelen tüm proteinlerin karmaşık bir karışımını içerecektir. Ham öz, biyoteknolojideki bazı uygulamalar için kullanılabilir, ancak saflık bir sorun olması durumunda, daha sonraki saflaştırma adımlarına uyulmalıdır. Ham protein özleri, kimyasallar ve enzimler, sonikasyon veya bir French Press kullanılarak elde edilen hücre lizisiyle üretilen hücre artıklarının giderilmesiyle hazırlanır.

Enkaz, santrifüjleme ile çıkarılır ve yüzer madde toparlanır. Hücre dışı proteinlerin ham hazırlıkları, hücrelerin santrifüjle basitçe çıkarılmasıyla elde edilebilir.

Bazı biyoteknoloji uygulamaları için termostabil enzimler için bir talep var: Denatüre olmadan yüksek sıcaklıklara tolere edebilen ve yüksek spesifik bir aktiviteyi sürdüren enzimler. Onları üreten organizmalar bazen aşırılık yanlısı olarak adlandırılır. Isıya dirençli bir proteinin saflaştırılmasında kolay bir yaklaşım, ısıyı ısıtmak, daha sonra solüsyonu soğutmak suretiyle karışımdaki diğer proteinleri denatüre etmektir (böylece termostabil enzimin reformasyona veya yeniden çözülmesine izin verilmektedir) Sonra denatüre proteinler santrifüjle çıkartılabilir.

Ara Saflaştırma Adımları

Geçmişte, bir ham özütten bir proteinin saflaştırılmasına ilişkin ortak bir ikinci adım, yüksek ozmotik mukavemetli bir çözeltide (yani, çöktürme ) idi.e. tuz çözeltileri). Ham ekstresindeki nükleik asitler, streptomisin sülfat veya protamin sülfat ile oluşturulmuş agregatların çökeltilmesi yoluyla çıkarılabilir. Protein çökeltmesi genellikle tuz olarak amonyum sülfat kullanılarak yapılır.

amonyum sülfat 'un farklı konsantrasyonlarında farklı proteinler çökelir. Genellikle düşük molekül ağırlıklı amonyum sülfat konsantrasyonlarında yüksek molekül ağırlıklı proteinler çökelir. Tuz çökeltmesi genellikle yüksek saflıkta bir proteine ​​yol açmaz, ancak bir karışımdaki bazı istenmeyen proteinlerin yok edilmesine ve numunenin konsantre hale getirilmesine yardımcı olabilir. Solüsyondaki tuzlar daha sonra gözenekli selüloz boru, filtrasyon veya jel eksklüzyon kromatografisi yoluyla diyaliz yoluyla giderilir.

Modern biyoteknoloji protokolleri, standart prosedürler için hazır çözümler sunan birçok ticari kitten yararlanır. Protein saflaştırma sıklıkla filtreler ve hazırlanmış jel filtrasyon sütunları kullanılarak yapılır. Yapmanız gereken tek şey, talimatları izleyerek doğru çözümü doğru miktarda ekleyin ve seçici (kolonun diğer ucundan çıkan) yeni bir test tüpü alırken belirli bir süre bekleyin.

Kromatografik yöntemler tezgah üstü sütunlar veya otomatik HPLC ekipmanı kullanılarak uygulanabilir. HPLC ile ayrılma, ters faz, iyon değiştirici veya boyut uzaklaştırma yöntemleri ve diyot dizisi veya lazer teknolojisi ile tespit edilen numuneler ile yapılabilir.

• Protein Görselleştirme ve Saflaştırmanın Değerlendirilmesi

  Ters fazlı kromatografi

  • (RPC) göreceli hidrofobik özelliklerine (999) göre proteinleri ayırır. Bu teknik oldukça seçicidir ancak organik çözücülerin kullanılmasını gerektirir. Bazı proteinler çözücüler tarafından kalıcı olarak denatüre edilir ve RPC sırasında işlevsellik kaybeder. Dolayısıyla, bu yöntem, özellikle hedef proteinin etkinliği koruması için gerekliyse tüm uygulamalar için önerilmez. İyon değişim kromatografisi ,
  • şarj 'a dayalı proteinlerin ayrılmasını ifade eder. Kolonlar ya anyon değişimi ya da katyon değişimi için hazırlanabilirler. Anyon değişimi sütunları, negatif yüklü proteinleri çeken pozitif yüklü durağan bir faz içerir. Katyon değişimi sütunları, pozitif yüklü proteinleri çeken ters, negatif yüklü boncuklardır. Hedef proteinin (lerin) elüsyonu, her proteinin yüklü fonksiyonel gruplarının değiştirilmesi veya nötrleştirilmesi ile sonuçlanan sütundaki pH'ın değiştirilmesi ile yapılır. Büyüklüğün eksklüzyon kromatografisi ( jel filtrasyon
  • ), daha büyük molekülleri kromatografi kolonundaki çapraz bağlı polimer yoluyla daha hızlı geçtiği için daha büyük proteinleri küçüklerden ayırır. Büyük proteinler polimer gözeneklerine sığmazken, daha küçük proteinler daha az doğrudan yolla kromatografi sütunu boyunca daha uzun sürebilir. Elüat, elüsyon süresine bağlı olarak proteinleri ayıran bir dizi tüp içerisinde toplanır. Jel filtrasyon, bir protein numunesinin konsantre edilmesi için yararlı bir araçtır çünkü hedef protein başlangıçta kolona eklenenden daha küçük bir elüsyon hacminde toplanır.Benzer filtreleme teknikleri, maliyet etkinliği nedeniyle büyük ölçekli protein üretimi sırasında kullanılabilir. Afinite kromatografisi , protein saflaştırma sürecini "cilalamak" veya tamamlamak için çok kullanışlı bir tekniktir. Kromatografi kolonundaki boncuklar, hedef proteine ​​spesifik olarak bağlanan ligandlara çapraz bağlanır. Protein daha sonra serbest ligand içeren bir solüsyon ile yıkanarak kolondan çıkarılır. Bu yöntem, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında en saf sonuçları ve en yüksek spesifik etkinliği verir.
  • SDS-PAGE , kendilerine büyük bir net negatif yük veren proteinlere bağlanan SDS (sodyum dodesil sülfat) varlığında gerçekleştirilen poliakrilamid jel elektroforezidir. Tüm proteinlerin yükleri oldukça eşit olduğundan, bu yöntem onları neredeyse tamamen boyuta göre ayırır. SDS-PAGE, bir dizideki her adımdan sonra proteinin saflığını test etmek için sıklıkla kullanılır. İstenmeyen proteinler karışımdan aşamalı olarak çıkarıldığından, arzu edilen proteini temsil eden tek bir bant buluncaya kadar SDS-PAGE jelinde görselleştirilen bant sayısı azaltılır.
• Immunoblotting afinite kromatografisi ile birlikte uygulanan bir protein görselleştirme tekniğidir. Belirli bir protein için antikorlar bir afinite kromatografısi kolonu üzerindeki ligandlar olarak kullanılır. Hedef protein sütun üzerinde tutulur, daha sonra kolonu bir tuz solüsyonu veya başka ajanlarla durulayarak çıkarılır. Radyoaktif veya boya etiketleriyle bağlantılı antikorlar, karışımın geri kalanından ayrıldıktan sonra hedef proteinin saptanmasına yardımcı olur.
• Kaynaklar: Zubay G. 1988. Biyokimya, 2. Baskı. Macmillan Publishing Co., New York, NY, ABD.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Saflaştırma El Kitabı, Baskı AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, ABD. // www. biyokimya. uiowa. edu / Donelson / Veritabanı% 20items / protein_purification_handbook. pdf.